Desarrollo de genes de referencia para RT.

Dec 26, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12296 (2023) Citar este artículo

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Jatropha curcas es un cultivo de oleaginosas con aplicaciones en biorrefinería. Si bien la torta generada después de la extracción de aceite ofrece potencial como fuente de proteínas para la alimentación animal, es necesaria la inactivación de los ésteres de forbol tóxicos presentes en el material. Pleurotus pulmonarius es un agente desintoxicante de la torta de jatrofa con potencial adicional como alimento para animales, hongos comestibles y para la producción de enzimas. Para la caracterización de genes fúngicos implicados en la degradación de ésteres de forbol, junto con otras aplicaciones industriales, la PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) es una herramienta que permite la cuantificación precisa de la expresión génica. Para ello, un análisis fiable requiere genes de referencia para la normalización de los niveles de ARNm validados en las condiciones empleadas para los genes diana. Se evaluó la estabilidad de los posibles genes de referencia β-TUB, ACTIN, GAPDH, PHOS, EF1α, TRPHO, LAC, MNP3, MYP y VP después del crecimiento de P. pulmonarius en torta de jatrofa tóxica y no tóxica y en un tratamiento combinado, respectivamente. Los algoritmos NormFinder y geNorm para el análisis de estabilidad de la expresión identificaron PHOS, EF1α y MNP3 como apropiados para normalizar la expresión génica. Las combinaciones de genes de referencia que contrastaban en la clasificación se compararon después de la normalización de la expresión relativa del gen CHU_2040, que codifica una enzima esterasa potencialmente implicada en la degradación del éster de forbol. Los genes de referencia de P. pulmonarius facilitarán el esclarecimiento de los mecanismos implicados en la desintoxicación de ésteres de forbol, así como el análisis de genes diana para su aplicación en modelos de biorrefinería.

El actual impulso global para reducir los impactos negativos de la industria en el medio ambiente ha llevado al desarrollo del concepto de bioeconomía, donde los sectores económicos se adaptan hacia la sostenibilidad utilizando recursos biológicos renovables para la producción de alimentos, materiales y energía. Las agroindustrias están experimentando una transformación en lo que respecta a las materias primas renovables, la producción con bajas emisiones de carbono y la optimización del uso de la tierra dentro de modelos integradores como las biorrefinerías. En este contexto, Jatropha curcas L., un cultivo de semillas oleaginosas con posibles aplicaciones industriales y agrícolas, se reconoce principalmente como un posible cultivo de biocombustible sostenible1,2,3. Sin embargo, existen dificultades para agregar valor al subproducto de la torta de jatrofa, que es un residuo lignocelulósico rico en proteínas, nitrógeno, fósforo, potasio y carbono. La aplicación de este residuo en la alimentación animal está actualmente limitada debido a la presencia de factores antinutricionales tóxicos y termoestables como los diterpenos de éster de forbol4,5,6.

Los terpenos son compuestos químicos derivados del metabolismo secundario de las plantas que juegan un papel fundamental en el desarrollo de las plantas, las interacciones ecológicas y las respuestas de defensa contra plagas y patógenos7,8. Estos compuestos químicos, si bien se utilizan ampliamente en procesos industriales como la producción de cosméticos, productos farmacéuticos, medicamentos e insecticidas7,9,10, también se encuentran entre los principales contaminantes que se acumulan en la producción industrial de pulpa y papel11. Ante esto, la bioprospección de microorganismos capaces de degradar dichas sustancias y sus derivados es de fundamental importancia en la biorremediación. La biodestoxificación de los ésteres de diterpeno forbol en la torta de jatrofa ofrece potencial para la aplicación posterior del residuo como fertilizante o complemento alimenticio para animales. Los microorganismos apropiados pueden permitir no solo la degradación de los compuestos tóxicos presentes, sino también potencialmente aumentar concomitantemente el valor nutricional o generar otros subproductos de valor agregado, como enzimas, compuestos bioactivos y/u hongos comestibles. Los genes y las vías metabólicas que subyacen al mecanismo de biodegradación del éster de forbol en la torta generada después de la extracción del aceite de J. curcas están actualmente poco explorados. Sin embargo, se ha demostrado que el crecimiento microbiano específico puede conducir a la secreción de enzimas extracelulares como esterasas, lipasas y proteasas, que desempeñan funciones en la degradación del diterpeno tóxico3,12.

Las especies de hongos del género Pleurotus se emplean hoy en día en la bioeconomía, en la química verde y en la producción de sustitutos de proteínas comestibles. Estos hongos cultivados, conocidos como hongos ostra, se encuentran entre los más cultivados a nivel mundial13. El éxito en la producción se debe principalmente a la eficiencia de fructificación y cultivo en diversos sustratos14. Los productos biotecnológicos son numerosos, con aplicaciones en biorremediación, micorremediación, biotratamiento y enriquecimiento de residuos lignocelulósicos, control biológico, desarrollo de productos catalíticos y en la producción de polisacáridos como el ergosterol15,16,17,18. Entre los hongos ostra, Pleurotus pulmonarius es eficaz en la degradación de ésteres de forbol en la torta de jatrofa, con potencial adicional para su aplicación en modelos de biorrefinería3. La identificación de genes en este hongo basidiomiceto que están involucrados en la degradación de los ésteres de forbol aún no se ha realizado y representa un paso importante hacia la degradación enzimática eficiente y la resolución de los cuellos de botella relacionados con la biodegradación. En este contexto, los enfoques de secuenciación de alto rendimiento para el análisis del transcriptoma fúngico serán apropiados para la identificación de genes expresados ​​y vías metabólicas activadas durante la degradación de este compuesto tóxico, así como genes adicionales que codifican y regulan la expresión de enzimas con diversas aplicación industrial3,12.

Para una cuantificación y validación precisas de los datos de expresión génica que se originan a partir de datos de secuencia del transcriptoma de alto rendimiento, la PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) es una herramienta analítica de referencia para su aplicación en diferentes condiciones experimentales19,20,21,22,23,24. Sin embargo, un análisis sólido requiere el empleo de un conjunto adecuado de genes de referencia para la normalización de la expresión de la transcripción, corrigiendo los datos en función de la variación entre muestras. De acuerdo con las directrices de Información mínima para la publicación de experimentos de PCR cuantitativos en tiempo real (MIQE)25, se requiere la normalización de la expresión de cada gen diana en relación con un gen de referencia para corregir los datos en busca de posibles variaciones entre las réplicas de muestras que a menudo ocurren durante la preparación del ADNc. . Para dicha normalización, se necesitan genes de referencia específicos para cada organismo que consideren las condiciones de crecimiento microbiano, el tipo de tejido y los momentos de expresión25,26,27. Un gen de referencia adecuado para la normalización de la expresión génica debe exhibir una expresión constante, independientemente de la muestra, la condición, el tratamiento, la célula y el tipo de tejido28,29. Para determinar los genes normalizadores más estables, generalmente se aplican diferentes algoritmos con distintos métodos estadísticos, que determinarán los mejores conjuntos de genes estables30,31,32.

La estabilidad genética de genes de referencia ha sido investigada previamente en diferentes especies del género Pleurotus, incluido Pleurotus ostreatus19,33,34,35; Pleurotus eryngii36 y Pleurotus tuber-regium37. Dado el potencial de P. pulmonarius tanto para la degradación de ésteres de forbol como para la aplicación concomitante en modelos de biorrefinería que utilizan torta de jatrofa como fuente de carbono, se justifica el análisis de la expresión de genes fúngicos. Por lo tanto, para un análisis futuro preciso de la expresión del gen diana, se requieren genes de referencia para RT-qPCR para esta especie. Este estudio investiga la confiabilidad de posibles genes de referencia para P. pulmonarius durante el crecimiento en torta de jatrofa, en presencia y ausencia de ésteres de forbol tóxicos.

Se probaron quince genes candidatos para determinar su especificidad y estabilidad como posibles genes de referencia para P. pulmonarius cultivado en torta de jatrofa en presencia y ausencia de ésteres de forbol. La información del cebador para cada gen evaluado se describe en la Tabla complementaria S1. De los 15 genes candidatos iniciales, cinco genes, a saber, PEP, ACTIN2, LAC2, CHS y α-TUB, no mostraron amplificación específica mediante RT-PCR y, por lo tanto, no se analizaron posteriormente mediante RT-qPCR. Para los 10 genes restantes, la especificidad de la amplificación del cebador para loci de un solo gen se confirmó mediante el análisis de las curvas de fusión, como se muestra en la figura complementaria S1, con picos únicos obtenidos para cada par de cebadores. Los valores de eficiencia de amplificación por PCR para los genes candidatos oscilaron entre 1,956 y 1,85, tras el cálculo con el software LinRegPCR (Tabla 1).

La variación en los valores de Cq (cuantificación del ciclo) para los 10 genes candidatos se analizó y presentó mediante una representación de diagrama de caja, donde es posible observar intervalos de expresión, valores promedio de Cq (media y mediana) y valores atípicos discrepantes. El análisis de cada gen se llevó a cabo en distintas condiciones, a saber, P. pulmonarius cultivado en torta de jatropha con presencia de éster de forbol tóxico (tratamiento T) (Fig. 1A), P. pulmonarius cultivado en torta de jatropha sin éster de forbol tóxico (tratamiento NT ) (Fig. 1B), y mediante la consideración de P. pulmonarius en ambas condiciones (denominado tratamiento combinado (C), que representa un conjunto de datos combinados de T y NT) (Fig. 1C). En presencia de ésteres de forbol tóxicos, los valores de Cq oscilaron entre 16,9 y 29,1 en todos los genes de referencia candidatos. Bajo esta condición, el gen ACTIN presentó el menor número de ciclos, lo que indica una mayor expresión que los otros genes candidatos, mientras que el gen de la peroxidasa (VP) presentó el valor de Cq más alto, lo que indica la menor expresión génica. La mayor variación de Cq se observó para el gen VP, siendo GAPDH el que presentó la menor variación de Cq, con un valor medio y mediana similar al gen EF1α. El gen LAC fue el único candidato que presentó valores atípicos para esta condición. Para la condición NT del cultivo de P. pulmonarius en torta de jatropha sin ésteres de forbol tóxicos, los valores de Cq oscilaron entre 15,6 y 30,8. Para esta condición, el gen MYP mostró el valor de Cq más alto, mientras que el valor de Cq más bajo se observó para el gen ACTIN, donde también se observó la mayor variación de Cq. El gen VP fue el único candidato en esta condición a presentar valores atípicos, observándose la variación más baja de Cq para el gen GAPH. Para la condición combinada, los genes ACTIN y VP mostraron los valores de Cq más bajos y más altos, respectivamente. Sin embargo, ambos genes mostraron una gran variación en Cq, como también se observó en el gen MYP. La variación más baja de Cq para esta condición se observó en los genes GAPDH y EF1α.

Presentación en diagrama de caja de las variaciones en los valores de Cq para los diez genes candidatos evaluados para estabilizar la expresión génica de Pleurotus pulmonarius cultivado en torta de jatrofa tóxica y no tóxica. (A) Tóxico, (B) no tóxico, (C) combinado.

La estabilidad de la expresión del gen de referencia candidato para P. pulmonarius cultivado en torta de jatropha que representa T, NT y datos combinados para los tratamientos se evaluó utilizando los algoritmos BestKeeper, geNorm y NormFinder. La clasificación de la estabilidad de la expresión según cada tratamiento biológico se resume en la Tabla 2.

El análisis con el algoritmo geNorm reveló estabilidad para los genes candidatos de P. pulmonarius β-TUB, PHOS, EF-1 y MNP3 en todas las condiciones de tratamiento, con valores de estabilidad por debajo del límite predeterminado de 0,5, lo que representa estabilidad (Fig. 2). Por el contrario, el gen VP mostró valores superiores a 0,5 en todos los tratamientos. Para los genes MYP, TRPHO y GAPDH, la estabilidad se observó solo durante el crecimiento del hongo durante el tratamiento T, con valores observados de 0,11, 0,12 y 0,472, respectivamente. Los genes LAC y ACTIN mostraron estabilidad sólo durante el tratamiento NT, con valores de 0,116 y 0,394, respectivamente. El análisis de variación por pares (V) se realizó utilizando geNorm para determinar el número mínimo de genes necesarios para normalizar la expresión génica en P. pulmonarius en pastel de J. curcas. Los datos presentados en la Fig. 3 muestran un valor de variación por pares de V2/3 de V <0,15 para todas las condiciones de crecimiento fúngico, lo que indica que dos genes de referencia son suficientes para la normalización de la expresión génica en todos los tratamientos.

Datos derivados del algoritmo GeNorm sobre la estabilidad de genes de referencia candidatos para normalizar la expresión génica mediante qPCR en Pleurotus pulmonarius en las tres condiciones analizadas: tóxica, no tóxica y combinada. Los valores de M por debajo de un límite de 0,5 indican una alta tasa de estabilidad.

Determinación basada en GeNormV de números óptimos de genes de referencia para una normalización precisa por RT-qPCR de la expresión del gen objetivo. Para todos los valores de datos por debajo de un valor de corte de 0,15, los genes de referencia adicionales no contribuyen significativamente a la normalización de los datos de expresión génica.

Los datos de clasificación de estabilidad genética luego del análisis con el algoritmo NormFinder se presentan en la Fig. 4. De acuerdo con los datos de clasificación obtenidos utilizando geNorm, los genes PHOS y EF1α mostraron la mayor estabilidad en todas las condiciones de tratamiento. En el caso del gen MNP3, el análisis con NormFinder indicó una alta estabilidad en la expresión en P. pulmonarius durante las condiciones de cultivo en torta tóxica de jatrofa y al considerar los datos de las condiciones combinadas. También de acuerdo con los datos de geNorm, los genes TRPHO y MYP mostraron una mayor estabilidad durante el crecimiento solo bajo la condición tóxica, mientras que los genes β-TUB, ACTIN y LAC, que también mostraron estabilidad solo durante la condición tóxica, mostraron un perfil de estabilidad NormFinder divergente. a partir de datos de clasificación de geNorm.

Datos derivados del algoritmo NormFinder sobre la estabilidad de genes de referencia candidatos para normalizar la expresión génica mediante qPCR en Pleurotus pulmonarius en las tres condiciones analizadas: tóxica, no tóxica y combinada. Los valores de M por debajo de un límite de 0,5 indican una alta tasa de estabilidad.

El análisis utilizando el programa BestKeeper reveló que solo el gen GAPDH mostraba un valor de desviación estándar inferior a 1 para P. pulmonarius en las tres condiciones distintas, y el gen EF1α mostraba un valor de 0,94 en P. pulmonarius durante el tratamiento NT (Tabla 2). Los resultados fueron generalmente discrepantes en relación con los obtenidos con los algoritmos geNorm y NormFinder, con la excepción del gen EF1α, que mostró estabilidad con los tres algoritmos empleados.

Para validar las clasificaciones de genes de referencia, se normalizó la expresión relativa del gen CHU_2040 frente a diferentes combinaciones de genes de referencia. Este gen codifica una enzima esterasa, potencialmente implicada en la degradación del éster de forbol. El análisis de los datos de secuencia de ARN de P. pulmonarius en J. curcas (no publicado) ha revelado que el gen CHU_2040 exhibe una expresión diferencial durante 3, 7 y 11 días de cultivo en torta de jatrofa tóxica en comparación con el cultivo en torta no tóxica. . Para las pruebas de normalización que utilizan el gen CHU_2040, se compararon varias combinaciones de genes clasificados como más estables (PHOS y EF1α; EF1α y MNP3) y menos estables (LAC y VP). La Figura 5 demuestra que la normalización de la expresión relativa del gen CHU_2040 utilizando las dos combinaciones de pares de genes más estables reveló un perfil de expresión positiva similar del gen a lo largo del tiempo investigado, aunque con variaciones en los niveles de expresión y con datos de RT-qPCR que respaldan datos silico. Por el contrario, la normalización con los dos genes candidatos menos estables dio como resultado distintos perfiles de expresión génica del gen CHU_2040 a lo largo del tiempo, con una mayor desviación estándar.

Niveles de expresión relativos del gen de esterasa CHU_2040 en Pleurotus pulmonarius utilizando los pares de genes de referencia más estables (EF1α y PHOS; EF1α y MNP3) y menos estables (LAC y VP). La RT-qPCR se realizó con tres réplicas biológicas, considerando la condición combinada C (conjuntos de datos para P. pulmonarius cultivado en torta de jatrofa tóxica y no tóxica). (A) EF1α y PHOS; (B) EF1α y MNP3; (C) LAC y VP.

Dada la posible aplicación de P. pulmonarius en la degradación de ésteres de forbol y el enriquecimiento concomitante de residuos lignocelulósicos3, el objetivo de este estudio fue identificar genes de referencia para normalizar los datos de expresión génica de P. pulmonarius cultivado en torta de jatrofa en presencia y ausencia de el éster tóxico de diterpeno forbol.

Se seleccionaron varios genes de referencia potenciales para su detección en P. pulmonarius durante el crecimiento en torta de jatrofa tóxica y no tóxica. Estas proteínas codificadas participan en actividades fúngicas constitutivas, como la β-tubulina y la actina 1, que participan en la actividad estructural, GAPDH, que participa en la glucólisis, PHOS, que desempeña un papel importante en la síntesis de aminoácidos y bases nitrogenadas. , EF1α, implicado en procesos de traducción, y TRPHO, implicado en la protección de membranas19,38,39,40.

Los algoritmos matemáticos de geNorm28, NormFinder29 y BestKeeper41 se han empleado ampliamente para el desarrollo de genes de referencia en diferentes reinos, y los datos combinados generalmente permiten una identificación precisa de genes normalizadores estables. Aquí, los datos obtenidos con NormFinder y geNorm mostraron una superposición para los genes más estables y menos estables, en contraste con los resultados obtenidos con BestKeeper. Las discrepancias en los resultados obtenidos con los diferentes software son comunes19. BestKeeper es un algoritmo que puede resultar inadecuado para muestras in vivo, ya que el modelo de cálculo aplicado (media geométrica de genes de referencia con una desviación estándar > 1) no se ajusta a las variaciones del sistema biológico y se limita a condiciones controladas23,42.

Según los resultados obtenidos con geNorm y NormFinder, la mayor estabilidad entre los genes constitutivos evaluados se observó con los genes PHOS y EF1α. Según Castanera y colaboradores19, el gen PHOS también mostró una alta estabilidad y es adecuado para normalizar la expresión génica en P. ostreatus utilizando los mismos algoritmos. El gen EF1α se introdujo recientemente como región de código de barras secundaria para la identificación molecular de hongos a nivel de especie43, incluidos los basidiomicetos del género Pleurotus44,45. Como tal, este gen también cumple con las pautas de genes de referencia ideales, con conservación en la secuencia de ADN objetivo, especificidad de especie, número de copias constante y sin variación alélica36. Anteriormente, se informó que el gen GAPDH no era adecuado para normalizar la expresión en el basidiomiceto P. tuber-regium, según los datos generados mediante el algoritmo geNorm37. En este caso también se demostró que el gen GAPDH no era adecuado para normalizar la expresión génica en P. pulmonarius cultivado en torta de jatrofa, al igual que el gen ACTIN. Castanera y colegas19 informaron que los genes constitutivos ACTIN, GAPDH1 y β-TUB, según los resultados generados con Genorm y NormFinder, eran los menos estables para normalizar la expresión génica en P. ostreatus cultivado en residuos lignocelulósicos. Claramente, el uso de genes constitutivos como genes de referencia sin validación de su estabilidad puede provocar errores en los análisis de expresión génica37,46. Teniendo en cuenta los informes anteriores sobre las tres especies de Pleurotus, el gen constitutivo GAPDH no parece ser adecuado para normalizar la expresión de genes en basidiomicetos del género Pleurotus.

Pleurotus pulmonarius pertenece a la clase de basidiomicetos saprotróficos, hongos que han desarrollado la capacidad de degradar los polímeros complejos que forman las paredes celulares de las plantas47,48. Dentro de los basidiomicetos, P. pulmonarius se clasifica como un hongo de pudrición blanca, capaz de degradar completamente la lignina mediante la acción de enzimas oxidativas48,49,50,51. La lacasa (LAC), la manganeso peroxidasa (MnP), la lignina peroxidasa (LiP) y la peroxidasa versátil (VP) son enzimas importantes en la degradación de la lignina y se supone que son las primeras en la línea de proteínas expresadas durante el catabolismo fúngico de la lignina49. Se ha informado que los miembros del género Pleurotus poseen genes que codifican MNP y VP, pero no genes que codifican LiP52. Dada la importancia de las enzimas oxidativas para los basidiomicetos saprotróficos, aquí también se analizaron los genes que codifican las proteínas LAC, MnP y VP para determinar la estabilidad genética. La literatura es escasa respecto a la selección de genes de referencia para P. pulmonarius, aunque el gen MYP ha sido descrito para la cuantificación QPCR de micelios de P. pulmonarius53. En nuestros resultados, el gen MYP mostró estabilidad sólo en condiciones de cultivo tóxicas. Además, este gen mostró el valor de Cq más alto tanto en condiciones tóxicas como no tóxicas, lo que sugiere que puede expresarse menos en estas condiciones. Los genes LAC y VP no mostraron estabilidad durante ninguna de las condiciones probadas, y los datos del diagrama de caja indicaron valores atípicos dentro de los análisis. A diferencia de los otros genes que codifican enzimas oxidativas, el gen MNP3, que codifica una manganeso peroxidasa distinta a la del gen MYP, mostró una alta estabilidad en las condiciones experimentales, al igual que los genes PHOS y EF1α.

Según Phengnuam y Suntornsuk54 y Nakao et al.55, las esterasas son las principales enzimas implicadas en la degradación de los ésteres de forbol por bacterias del género Bacillus. Basado en datos internos de secuencia de ARN para P. pulmonarius en torta de jatrofa tóxica y no tóxica (no publicados), el gen CHU_2040 codifica una esterasa potencialmente involucrada en la degradación completa de los ésteres de forbol. Mediante comparación con datos de RNA-seq, se utilizó la expresión relativa de este gen para validar la estabilidad de los genes de referencia. Cuando se aplicaron las combinaciones de genes estables mejor clasificadas (PHOS-EF1α y EF1α-MNP3) para normalizar la expresión relativa del gen CHU_2040, los resultados de expresión diferencial se alinearon con los datos in silico. Por el contrario, cuando se emplearon los genes de referencia menos estables para la normalización, a saber, LAC y VP, el patrón de expresión de CHU_2040 exhibió un perfil distinto que divergió significativamente de los datos de expresión in silico, revelando su inadecuación como genes de normalización bajo las condiciones de crecimiento específicas empleadas. para P. pulmonarius. Estos resultados mostraron claramente que diferentes genes de referencia pueden influir en la expresión relativa de genes diana en condiciones de crecimiento específicas.

En resumen, esta primera investigación sobre el desarrollo de genes de referencia para P. pulmonarius identificó tres genes estables adecuados para normalizar la expresión genética durante el cultivo en torta de jatrofa con o sin el compuesto tóxico éster de forbol. Además, los análisis de variación pareada mostraron que la normalización genética se puede realizar con dos genes de referencia. Si bien P. pulmonarius ofrece una importancia considerable en biotecnología, los datos relacionados con la investigación molecular de este hongo son todavía relativamente limitados. Junto con el genoma de referencia reciente para P. pulmonarius16, el conjunto de genes de referencia desarrollado aquí para la normalización de la expresión génica es apropiado para futuros análisis transcriptómicos y validación de la expresión génica de este hongo en este residuo lignocelulósico.

Las tortas se obtuvieron prensando mecánicamente semillas de accesiones genéticas de J. curcas no tóxicas (adquisición 169) y tóxicas (adquisición 123), todas proporcionadas por el banco de germoplasma de Embrapa Agroenergia. Antes del prensado, las semillas se calentaron individualmente a 60 °C durante dos horas utilizando un secador mezclador rotatorio (SCOLT TECH, ERT 60 II). Luego, las semillas prensadas se procesaron utilizando un extractor de aceite y grasa (SCOLT TECH, SMR 610-6) para obtener tanto el aceite crudo como las tortas que se emplearon en este estudio. La extracción metanólica de los ésteres de forbol y la cuantificación por HPLC se realizó siguiendo el método descrito por Gomes et al.3. La concentración de ésteres de forbol en la torta tóxica se midió en 2,17 mg/g, mientras que la torta no tóxica no contenía niveles detectables de ésteres de forbol usando la técnica empleada.

La cepa Pleurotus pulmonarius BRM 055674, procedente de la colección de basidiomicetos de Embrapa Agroenergia, fue preservada según el método Castellani56. Posteriormente, los discos miceliales se transfirieron a medio de cultivo agar Jatropha3 y se incubaron a 28 °C durante 7 días. Como se describió anteriormente, en bioensayos se emplearon variedades disponibles naturalmente no tóxicas de J. curcas57 que no sintetizan o tienen cantidades mínimas de ésteres de forbol como controles para el análisis de la modulación de la expresión génica después del crecimiento fúngico en torta tóxica de jatrofa. Para el cultivo en estado sólido, se humedecieron 100 g de cada sustrato de torta de jatrofa tóxica y no tóxica hasta un 70% de humedad y se transfirieron a placas de Petri de 150 mm x 20 mm. Después de la esterilización, se inocularon tapones de micelio de P. pulmonarius de 7 días de edad en torta de jatrofa tóxica (tratamiento T) o torta de jatrofa no tóxica (tratamiento NT), luego se incubaron a 28 °C. Los micelios de hongos que colonizan los sustratos se recolectaron en tres momentos durante un período de incubación de 3, 7 y 11 días. Todos los bioensayos se realizaron por triplicado. Como se describió anteriormente, la tercera condición analizada correspondió a una combinación de conjuntos de datos de tratamiento T y NT y se denomina condición combinada en todo momento (tratamiento C).

Se recolectaron muestras de micelio de P. pulmonarius de la superficie de torta de jatropha colonizada para ambos tratamientos a los 3, 7 y 11 días después de la inoculación (DAI). La micelia se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y luego se almacenó a -80 °C. La extracción y purificación del ARN total para cada tratamiento se realizó utilizando un kit INVITRAP® SPIN PLANT RNA (Stratec Molecular GMBH, Berlín, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN total se trató con DNasa I (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE. UU.) para eliminar el ADN genómico residual. La concentración y la integridad del ARN total se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y espectrofotometría Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Para la síntesis de ADNc, a partir de triplicados biológicos para cada condición experimental (3DAI_NT, 3DAI_T, 7DAI_NT, 7DAI_T, 11DAI_NT, 11DAI_T), se transcribió inversamente un total de 1 μg de ARN total a ADNc utilizando cebadores Super Script II RT y Oligo (dT). (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.).

Para seleccionar posibles genes de referencia con expresión estable en P. pulmonarius cultivado en desechos de torta de jatropha, se seleccionaron genes candidatos para la detección que codifican proteínas probablemente involucradas en las actividades de las células basales en diversas especies del género Pleurotus (Tabla complementaria S1). Se empleó el software PrimerQuest Tool (Integrated DNA Technologies—IDT, Iowa, EUA) para el diseño de cebadores específicos para cada gen de referencia candidato. Los amplicones diana esperados variaron de 90 a 120 pb, con cada par de cebadores diseñado hacia las uniones exón-exón predichas, para evitar la amplificación del ADN genómico y garantizar la amplificación del ADNc. La especificidad de los pares de cebadores se probó inicialmente mediante PCR in silico frente a una base de datos local de datos de RNAseq para P. pulmonarius. Luego se probaron la especificidad y eficiencia del cebador frente al ADNc procedente de los triplicados biológicos de cada condición experimental para P. pulmonarius cultivado en torta de jatrofa tóxica y no tóxica.

Se empleó un kit Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG con ROX (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) para el análisis RT-qPCR de la expresión de posibles genes de referencia. Las amplificaciones por PCR se realizaron utilizando un termociclador de PCR en tiempo real ABI StepOne® (Applied Biosystems, Foster City, EE. UU.). La amplificación por PCR se realizó en tres réplicas experimentales y tres réplicas técnicas por tratamiento. Cada reacción de PCR comprendió 2 µL de una dilución 1:20 de ADNc molde, 0,2 µM de cada cebador y 5 µL de Platinum® SYBR® Green qPCR Super Mix-UDG con kit ROX (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.), hasta un volumen final de 10 μL. El termociclado de PCR comprendió 52 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 s, seguido de hibridación con cebador y extensión a 62 °C durante 60 s. El análisis de la Tm (disociación) de los amplicones se realizó utilizando el software SDS 2.2.2 (Applied Biosystems, Foster City, EE. UU.) para verificar la especificidad de los cebadores. Se aplicaron datos sin procesar de ΔRn para determinar la eficiencia de RT-qPCR para cada gen utilizando el programa LinRegPCR, versión 2017.1 (//www.gear-genomics.com/rdml-tools/).

El análisis de estabilidad y la validación de la expresión de cada gen de referencia candidato se basaron en los valores del ciclo de cuantificación (Cq) para cada muestra de ADNc. Este valor indica el número total de ciclos de amplificación durante la fase de amplificación exponencial de la PCR que se necesitan para alcanzar un valor umbral predeterminado para la detección de amplificación. La estabilidad de la expresión de cada gen se determinó mediante los algoritmos analíticos geNorm28, NormFinder29 y BestKeeper41. También se empleó GeNorm para calcular la estabilidad de la expresión basándose en un valor M promedio, que representa la variación por pares de un gen particular frente a todos los demás genes. La mayor estabilidad en la expresión está representada por los valores M más bajos, y los genes más estables muestran valores M por debajo de un umbral de 0,5. GeNorm también calcula el valor V de variación por pares (Vn/n + 1) entre cada gen de referencia potencial, para determinar el número óptimo de genes de referencia para su empleo en la normalización de la expresión génica. Posteriormente, se utilizó el software qbase+ (CellCarta, Montreal, Quebec) para calcular los ciclos de cuantificación promedio (Cqs) por gen y el software GraphPad Prism v7 (Dotmatics, Boston, EUA) para el análisis estadístico.

Se compararon las combinaciones de los genes más estables (PHOS y EF1α; MNP3 y EF1α) y los genes de referencia menos estables (LAC y VP) para la normalización de la expresión relativa del gen CHU_2040, que codifica una enzima esterasa, potencialmente implicada en el éster de forbol. degradación. La extracción de ARN, la síntesis de ADNc y la qPCR se realizaron como se describió anteriormente. Se empleó el software qbase + (Biogazelle) para calcular los ciclos de cuantificación promedio (Cqs) por gen, y se empleó el software GraphPad Prism v7 para el análisis estadístico de la condición combinada.

Todos los datos generados y analizados durante el estudio se incluyen en el artículo publicado y sus archivos de información complementaria.

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Este trabajo fue financiado por los organismos de financiación brasileños FAPDF (Subvención 193.001195/2016), CNPq/Embrapa (Subvención 404786/2013-8) y CAPES (Subvenciones Capes-Embrapa 15/2014 y Código de Finanzas CAPES 001). La RNGM contó con el apoyo de una beca del CNPq (Beca 308165/2021-7).

Estos autores contribuyeron por igual: Taísa Godoy Gomes y Fernando Campos de Assis Fonseca.

Departamento de Biología Celular, Instituto de Ciencias Biológicas, Universidad de Brasilia, Campus Universitario Darcy Ribeiro, Brasilia, DF, 70910-900, Brasil

Taísa Godoy Gomes, Fernando Campos de Assis Fonseca, Gabriel Sergio Costa Alves & Robert Neil Gerard Miller

Instituto Federal de Goiás (IFG), Águas Lindas, GO, 72910-733, Brasil

Fernando Campos de Assis Fonseca

Embrapa Agroenergia, STN-70297-400, Brasilia, DF, 70297-400, Brasil

Félix Goncalves de Siqueira

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RNGM, FCAF, GSCA y FGS concibieron y diseñaron el estudio. TGG realizó los bioensayos y el análisis RT-qPCR. FCAF realizó un análisis RT-qPCR. TGG, FCAF, GSCA, FGS y RNGM analizaron los datos, proporcionaron aportes intelectuales, escribieron y revisaron el manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

Correspondencia a Robert Neil Gerard Miller.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Gomes, TG, de Assis Fonseca, FC, Alves, GSC et al. Desarrollo de genes de referencia para el análisis RT-qPCR de la expresión génica en Pleurotus pulmonarius para aplicaciones biotecnológicas. Informe científico 13, 12296 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39115-4

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Recibido: 25 de abril de 2023

Aceptado: 20 de julio de 2023

Publicado: 29 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39115-4

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